一、PCR的基本原理
 

　　聚合酶鏈反應(yīng)(polymerasechainreaction，PCR)PCR反應(yīng)過程與細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制相似，但PCR的反應(yīng)體系要簡單的多，主要包括DNA靶序列、引物、4種單核苷酸dNTP、耐熱DNA聚合酶以及合適的緩沖液體系。
 

　　PCR反應(yīng)過程有以下3個步驟：
 

　　1、變性
 

　　將反應(yīng)體系混合物加熱到94℃，維持較短時間(大約15s-30s)，使目標(biāo)DNA雙螺旋的氫鍵斷裂，形成單鏈DNA作為反應(yīng)模板。
 

　　2、退火
 

　　將反應(yīng)體系冷卻至特定的溫度(引物的TM值左右或以下)，引物與DNA模板的互補區(qū)結(jié)合，形成模板引物復(fù)合物。
 

　　3、延伸
 

　　將反應(yīng)體系的溫度提高到72℃并維持一段時間，引物在耐熱聚合酶的作用下，以引物為固定起點，以4種單核苷酸(dNTP)作為底物合成新的DNA鏈。
 

　　以上三步作為一個循環(huán)重復(fù)的進(jìn)行，每一循環(huán)的產(chǎn)物作為下一循環(huán)的模板。如此循環(huán)數(shù)十次，從而使目的基因得到指數(shù)級擴(kuò)增，達(dá)到檢測或獲取基因的目的。
 

　　二、PCR儀的分類
 

　　根據(jù)DNA擴(kuò)增的目的和檢測的標(biāo)準(zhǔn)可以將PCR儀分為：普通PCR儀，梯度PCR儀，原位PCR，實時熒光定量PCR儀等幾類。
 

　　2.1普通PCR儀
 

　　一般把一次PCR擴(kuò)增只能運行一個特定退火溫度的PCR儀，稱之為普通PCR儀。
 

　　如果要用它做不同的退火溫度則需要多次運行。主要是用作簡單的，對目的基因退火溫度的擴(kuò)增。
 

　　主要應(yīng)用于科研、教學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、檢驗、檢疫等。
 

　　2.2梯度PCR儀
 

　　一次性PCR擴(kuò)增可以設(shè)置一系列不同的退火溫度條件(通常12種溫度梯度)的稱之為梯度PCR儀。
 

　　因為被擴(kuò)增的不同的DNA段其適合的退火溫度不同，通過設(shè)置一系列的梯度退火溫度進(jìn)行擴(kuò)增，從而一次性PCR擴(kuò)增就可以篩選出表達(dá)量高的適合退火溫度進(jìn)行有效的擴(kuò)增。主要用于研究未知DNA退火溫度的擴(kuò)增，這樣既節(jié)約時間，也節(jié)約經(jīng)費。
 

　　在不設(shè)置梯度的情況下亦可當(dāng)做普通的PCR用。真正的梯度，是每一排管都有準(zhǔn)確的加熱控溫探頭。
 

　　梯度PCR儀多應(yīng)用于科研、教學(xué)機(jī)構(gòu)。
 

　　2.3原位PCR儀
 

　　有些品牌的PCR儀具有普通PCR、梯度PCR、原位PCR的功能，通過替換模塊進(jìn)行多用途開展實驗工作。是用于從細(xì)胞內(nèi)靶DNA的定位分析的細(xì)胞內(nèi)基因擴(kuò)增儀。如病原基因在細(xì)胞的位置或目的基因在細(xì)胞內(nèi)的作用位置等?？杀３旨?xì)胞或組織的完整性，使PCR反應(yīng)體系滲透到組織和細(xì)胞中，在細(xì)胞的靶DNA所在的位置進(jìn)行基因擴(kuò)增。
 

　　不但可以檢測到靶DNA，還能標(biāo)出靶序列在細(xì)胞內(nèi)的位置。于分子和細(xì)胞水平上研究疾病的發(fā)病機(jī)理和臨床過程及病理的轉(zhuǎn)變有著重大的實用價值。
 

　　2.4實時熒光定量PCR儀(fluorescencerquantitivepolymerasechainreaction,FQPCR)
 

　　在普通PCR儀設(shè)計基礎(chǔ)上增加熒光信號激發(fā)和采集系統(tǒng)和計算機(jī)分析處理系統(tǒng)，形成了具有熒光定量PCR功能的儀器。
 

　　其PCR擴(kuò)增原理和普通PCR擴(kuò)增原理相同，在PCR擴(kuò)增時加入的引物是利用同位素、熒光素等進(jìn)行標(biāo)記，使用引物和熒光探針同時與模板特異性結(jié)合擴(kuò)增。擴(kuò)增的結(jié)果通過熒光信號采集系統(tǒng)實時采集信號連接輸送到計算機(jī)分析處理系統(tǒng)，得出量化的實時結(jié)果輸出。
 

　　熒光定量PCR儀有單通道，雙通道和多通道之分。當(dāng)只用一種熒光探針標(biāo)記的時候，選用單通道；有多種熒光標(biāo)記的時候使用多通道。單通道也可以檢測多熒光的標(biāo)記和目的基因表達(dá)產(chǎn)物，因為一次只能檢測一種目的基因的擴(kuò)增量，需多次擴(kuò)增才能檢測完不同的目的基因片段的量。多通道利于做多重PCR，實現(xiàn)一次檢測多種目的基因的功能。
 

　　實時熒光定量PCR儀主要應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)檢測、生物醫(yī)藥研發(fā)、食品行業(yè)、科研院校等。
 

　　實時熒光定量PCR儀+實時熒光定量試劑+通用電腦+自動分析軟件，構(gòu)成PCR-DNA/RNA實時熒光定量檢測系統(tǒng)。
 

　　實時熒光定量PCR的優(yōu)勢：
 

　　熒光定量PCR儀比普通的PCR儀多了熒光信號采集系統(tǒng)和計算機(jī)分析處理系統(tǒng)，實時熒光定量PCR儀主要是用來定量分析和確定基因轉(zhuǎn)錄水平的，而普通的PCR儀是做定性分析和擴(kuò)增基因片段，定量PCR儀可以做普通PCR儀的工作，但是成本太高。
 

　　樣品到達(dá)域值水平所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)稱為Ct值(限制點的循環(huán)數(shù))。域值應(yīng)設(shè)定在使指數(shù)期的擴(kuò)增效率為大，這樣可以獲得準(zhǔn)確，可重復(fù)性的數(shù)據(jù)。如果同時擴(kuò)增的還有標(biāo)有相應(yīng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，線性回歸分析將產(chǎn)生一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以用來計算未知樣品的濃度。
 

　　熒光定量PCR儀特點：
 

　　1.特異性強(qiáng)：引物和探針的“雙保險”，避免檢測的假陽性。
 

　　2.靈敏度高：分析PCR產(chǎn)物的對數(shù)期，自動化儀器收集熒光信號，避免了許多人為因素干擾。
 

　　3.避免污染：全封閉反應(yīng)，無須PCR后處理。
 

　　4.實現(xiàn)定量：運用標(biāo)準(zhǔn)品獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)合Ct值進(jìn)行準(zhǔn)確定量。
 

　　5.高效低耗：可實現(xiàn)一管多檢。
 

　　6.操作簡便：在線式實時監(jiān)測擴(kuò)增結(jié)果，不必接觸有害物質(zhì)。
 

　　7.快速：反應(yīng)時間<1.5小時。
 

　　三、PCR常見問題匯總
 

　　1.無擴(kuò)增條帶
 

　　(1)酶失活或在反應(yīng)體系中未加入酶。TaqDNA聚合酶因保存或運輸不
 

　　當(dāng)而失活，往往通過更換新酶或用另一來源的酶以獲得滿意的結(jié)果。
 

　　(2)模板含有雜質(zhì)。特別是對甲醛固定及石蠟包埋的組織常含甲酸，
 

　　造成DNA脫嘌呤而影響PCR的結(jié)果。
 

　　(3)變性溫度是否準(zhǔn)確：PCR儀指示溫度與實際溫度是否相符，過高酶
 

　　在前幾個循環(huán)就迅速失活；過低則模板變性不*。
 

　　(4)反應(yīng)系統(tǒng)中污染了蛋白酶及核酸酶，應(yīng)在未加Taq酶以前，將反應(yīng)
 

　　體系95℃加熱5-10分鐘。
 

　　(5)引物變質(zhì)失效。人工合成的引物是否正確。是否純化，或因儲存
 

　　條件不當(dāng)而失活。
 

　　(6)引物錯誤。利用BLAST檢查引物特異性或重新設(shè)計引物。
 

　　(7)DNA凝膠電泳時加入陽性對照，確保不是DNA凝膠和PCR程序的問
 

　　題。
 

　　2.PCR產(chǎn)物量過少
 

　　(1)退火溫度不合適。以2度為梯度設(shè)計梯度PCR反應(yīng)優(yōu)化退火溫
 

　　度。
 

　　(2)DNA模板量太少。增加DNA模板量。
 

　　(3)PCR循環(huán)數(shù)不足。增加反應(yīng)循環(huán)數(shù)。
 

　　(4)引物量不足。增加體系中引物含量。
 

　　(5)延伸時間太短。以1kb/分鐘的原則設(shè)置延伸時間。
 

　　(6)變性時間過長。變性時間過長會導(dǎo)致DNA聚合酶失活。
 

　　(7)DNA模板中存在抑制劑。確保DNA模板干凈
 

　　3.擴(kuò)增產(chǎn)物在凝膠中涂布或成片狀條帶彌散
 

　　(1)酶量過高。減少酶量；酶的質(zhì)量差，調(diào)換另一來源的酶。
 

　　(2)dNTP濃度過高。減少dNTP的濃度。
 

　　(3)MgCl2濃度過高?？蛇m當(dāng)降低其用量。
 

　　(4)模板量過多。質(zhì)粒DNA的用量應(yīng)<50ng，而基因組DNA則應(yīng)
 

　　<200ng。
 

　　(5)引物濃度不夠優(yōu)化。對引物進(jìn)行梯度稀釋重復(fù)PCR反應(yīng)。
 

　　(6)循環(huán)次數(shù)過多；增加模板量減少循環(huán)次數(shù)至30，縮短退火時間及
 

　　延伸時間，或改用二種溫度的PCR循環(huán)。
 

　　(7)退火溫度過低。
 

　　(8)電泳體系有問題：
 

　?、倌z中緩沖液和電泳緩沖液濃度相差太大；
 

　?、谀z沒有凝固好；
 

　　③瓊脂糖質(zhì)量差。
 

　　(9)若為PCR試劑盒則可能：
 

　?、儆捎谶\輸儲存不當(dāng)引起試劑盒失效；
 

　?、谠噭┖斜旧碣|(zhì)量有問題，如引物選擇、循環(huán)參數(shù)等選擇不當(dāng)。
 

　　(10)降解的陳舊模板擴(kuò)增也易產(chǎn)生涂布。
 

　　4.擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)多條帶(雜帶)
 

　　(1)引物用量偏大，引物的特異性不高。應(yīng)調(diào)換引物或降低引物的使
 

　　用量。
 

　　(2)循環(huán)的次數(shù)過多。適當(dāng)增加模板的量，減少循環(huán)次數(shù)。
 

　　(3)酶的用量偏高或酶的質(zhì)量不好，應(yīng)降低酶量或調(diào)換另一來源的
 

　　酶。
 

　　(4)退火溫度偏低，退火及延伸時間偏長。應(yīng)提高退火溫度，減少變
 

　　性與延伸時間，也可采用二種溫度的PCR擴(kuò)增。以2度為梯度設(shè)計梯度
 

　　PCR反應(yīng)優(yōu)化退火溫度。
 

　　(5)樣品處理不當(dāng)。
 

　　(6)Mg2+濃度偏高，因適當(dāng)調(diào)整Mg2+使用濃度。
 

　　(7)若為PCR試劑盒，也可能時試劑盒本身質(zhì)量有問題。
 

　　(8)復(fù)制提前終止。使用非熱啟動的聚合酶時常有發(fā)生。冰上準(zhǔn)備
 

　　反應(yīng)體系或采用熱啟動聚合酶。
 

　　(9)反應(yīng)緩沖液未*融化或未充分混勻。確保反應(yīng)緩沖液融化完
 

　　全并*混勻。
 

　　(10)引物特異性差。利用BLAST檢查引物特異性或重新設(shè)計引物。
 

　　(11)引物量過多。減少反應(yīng)體系中引物的用量。
 

　　(12)模板量過多。質(zhì)粒DNA的用量應(yīng)<50ng，而基因組DNA則應(yīng)
 

　　<200ng。
 

　　(13)外源DNA污染。確保操作的潔凈。
 

　　5.陰性對照出現(xiàn)條帶
 

　　試劑，槍頭，工作臺污染。使用全新的試劑和槍頭，對工作臺進(jìn)行清
 

　　潔。
 

　　6.條帶大小與理論不符
 

　　1)污染。使用全新的試劑和槍頭，對工作臺進(jìn)行清潔。
 

　　2)模板或引物使用錯誤。更換引物和模板。
 

　　3)基因亞型。對研究的基因進(jìn)行序列分析和BLAST研究。